样本提交指南

样本可以在免疫组库测序工作流程的任何阶段（从核酸提取到扩增再到测序）转移到 iRepertoire 进行文库制备和测序。此外，材料可以来自各种不同类型的样本。无论您计划依靠 iRepertoire 进行核酸提取、文库制备、测序还是以上所有操作，本页面都提供了样本提交指南。

提交样本进行核酸提取

对于提交细胞，我们希望提交至少 1,000 个分离细胞。但是，由于我们的技术足够灵敏，可以放大到单细胞水平，因此我们将接受少至 250 个细胞。处理少于 250 个细胞样本的研究人员需要进行项目咨询。有几种方法可以存储和发送您的细胞样本，您的项目需求将取决于哪种方式最适合您。

  • 如果您的样本不需要任何下游染色或分选（即仅进行核酸提取），我们建议将其存储在 Qiagen RLT 裂解缓冲液中。请使用下表确定您的样本所需的 RLT 体积：
  • 如果您没有 RLT 缓冲液，并且您的细胞不需要任何下游染色/分选（即仅提取核酸），我们建议将其存储在 Qiagen 的 RNAprotect 细胞试剂中。离心细胞，去除所有上清液，然后完全重新悬浮在 RNAprotect 细胞试剂中。根据制造商的规格使用体积。只需要提取核酸的细胞也可以干速冻。也可以提交冷冻保存的细胞和不使用稳定缓冲液冷冻的细胞，但可能需要支付额外费用。

为了提交组织，我们可以接受 FFPE 样本或整个组织活检。

  • 如果您计划提交 FFPE 样本，我们要求至少提供 5 张厚度为 10 微米的载玻片（或 50 微米的 FFPE 组织）。FFPE 提取是在 Covaris 上通过超声处理进行的，这有助于提高完整 RNA 的产量。
  • 我们还可以接受速冻组织或储存在 RNAlater 中的组织。这些样本外包给 HudsonAlpha Discovery 实验室进行提取。对于固体组织提交，我们可以接受 5 毫克至 30 毫克的全组织。注意：大多数商用提取试剂盒的最大容量因组织类型而异，但通常最大容量为 30 毫克。

对于提交全血，请参阅我们关于血液采集和样本注意事项的详尽文章。  

提交遗传物质进行文库制备

对于服务样品，我们要求的核酸量比单次反应所需的量要多，以便在必要时有足够的核酸进行重复扩增。如果难以获得下面列出的数量，我们经验丰富，可以从低至 200 pg 的 RNA 输入量实现扩增。样品的质量和纯度是比输入量更重要的参数。

所有样品均应在无核酸酶的水中提交，并装在 1.5 mL 微量离心管中运输。对于 RNA 和 DNA 提交，请提交不少于 15 uL 的样品。

对于 RNA，我们更希望其质量为 A260/280 ≥2.0 或 RIN 值为 7 或更高。我们的长读引物系统在 RIN 值高于 7 时效果最佳，但对于 RIN 值在 5-7 范围内的样本，我们建议使用短读引物​​。我们也成功处理了 RIN 值低于 5 的样本。

  • FFPE RNA
    • 最小浓度 5 ng/uL，最小质量 75 ng
    • 最佳浓度为 20 ng/uL，最佳质量为 300 ng
  • 固体组织RNA
    • 最小浓度 5 ng/uL，最小质量 75 ng
    • 最佳浓度为 50 ng/uL，最佳质量为 1000 ng
  • PBMC/全血 RNA
    • 最小浓度 5 ng/uL，最小质量 75 ng
    • 最佳浓度为 50 ng/uL，最佳质量为 1000 ng
  • 分离的细胞群
    • 最小浓度 1 ng/uL，最小质量 15 ng
    • 最佳浓度为 10 ng/uL，最佳质量为 200 ng

对于 gDNA，我们通常要求每个样本 1 – 5 µg，A260/280 ≥1.8，最低浓度为 200 ng/µL。对于从更难提取的来源（如 FFPE）中提取的 gDNA，我们通常要求 1-5 ug 的 gDNA，最低浓度为 70 ng/uL。

内部文库准备的建议

使用 iRepertoire 试剂进行文库制备时，您需要使用的 RNA 输入量取决于起始样本类型。样本类型会影响制备的核酸样本中免疫特异性 RNA 的比例以及质量。基本上，样本类型越纯化，实现所需免疫特异性扩增所需的 RNA 模板量（以 ng 为单位）就越少。

如果您使用的是全血、肿瘤或其他各种组织类型的总 RNA，并且没有下游细胞分选，那么我们建议使用 1 ug RNA。这些样本类型中可能有很多非免疫特异性 RNA 会作为背景，因此您需要确保有足够的免疫特异性 RNA 进入反应。

如果您使用的是 PBMC，那么您可以使用较少的 RNA 模板，通常为 300 – 500 ng。如果您使用的是从具有大量免疫特异性细胞的组织类型（例如淋巴组织）中提取的 RNA，那么您也可以在反应中使用较少的 RNA 模板。

当使用已分选的细胞时，您可以使用更少的 RNA 模板，因为免疫特异性 RNA 的浓度更高。当使用已分选的细胞时，我们使用的 RNA 仅为 20 pg（优质、完整）。

还需要考虑的是可以添加到第一个 PCR 反应中的总体积：13.75 ul。RNA 的浓度需要允许您将所需的起始模板量（以 ng 为单位）放入这 13.75 ul 中。如果您有一个非常浓缩的 RNA 样本，那么您可以使用无核酸酶的水弥补 13.75 ul 的差额。例如，如果您的 RNA 样本是 250 ng/ul 并且您想要添加 500 ng 模板，则需要添加 2 ul RNA 模板和 11.75 ul 水。

最终，必须根据经验确定反应中添加的模板的适当数量。如果要比较一个样本与另一个样本，研究人员应该从相似的细胞计数开始，并且每个反应输入的模板质量相同。

根据我们的经验，质量而非数量是成功进行免疫组库实验的最重要因素。在项目开始前规划收集策略、样品储存和核酸提取步骤，一旦实际实验室工作开始，就会在质量数据方面带来回报。

提交准备好的样本库进行测序

我们建议您向我们发送 1ug 的混合文库，其浓度至少为 20ng/ul，A260/280 比至少为 1.8（更高也可以）。预制备的文库可以悬浮在各种缓冲液中，包括 10 mM Tris、dH 2 O 或 Qiagen EB。最关键的要求是缓冲液中含有的 EDTA 不超过 0.1 mM。如果混合文库的浓度太低，我们建议使用 PCR 纯化试剂盒浓缩样品，方法是将样品反复应用到同一柱中并以较小的体积洗脱。

建议的试剂盒/试剂

一般而言，商业试剂盒可提供最佳结果，我们直接遵循其协议。我们确实建议使用 FFPE 专用试剂盒来处理 FFPE 样本，因为这些样本可能具有挑战性。此外，我们建议使用 Quiagen 试剂盒而不是 Beckman 试剂盒。在我们手中，Beckman 试剂盒的产量明显较低，卷曲约为 20-30ng/ul。

对于核酸提取，我们推荐以下试剂盒：

  • RNA，人类和小鼠细胞或组织： Qiagen® RNeasy Mini 试剂盒（www.qiagen.com 目录号 #74104）。该试剂盒适用于 5 x 10 5 – 1 x 10 7之间的细胞计数。
  • RNA、低计数的人类和小鼠细胞样本： Qiagen® RNeasy Micro 试剂盒（www.qiagen.com 目录号 #74004）。此试剂盒适用于细胞计数 ≤ 5 x 10 5。此试剂盒还含有载体 RNA，有助于减少提取过程中样本 RNA 的损失。当细胞数量少于 500 个时，应在细胞均质化之前添加载体 RNA。
  • RNA、人类和小鼠组织：   Norgen 动物组织 RNA 纯化试剂盒（www.norgenbiotek.com 目录号 #25700）。我们过去曾测试过此试剂盒，效果良好。如果不立即处理组织，Norgen 试剂盒建议在液氮中速冻并在 -70 度下储存。如果不速冻，组织样本应在 Qiagen® RNAlater（www.qiagen.com 目录号 #76106）中在 2-8°C 下储存长达 4 周。
  • RNA、FFPE 样本： Qiagen® FFPE RNA（货号 #73504）纯化试剂盒。在公司内部，我们还在淋巴结切片上测试了 Stratagene 的 Absolutely RNA FFPE 试剂盒（货号 400809），并且我们知道其他研究人员也曾在 FFPE 肾活检样本上使用该试剂盒。如果您有条件的话，我们使用 Covaris ME220 和声波超声从 FFPE 样本中提取 RNA 取得了最佳成功，这有助于提高完整 RNA 链的产量。
  • DNA 和 RNA，人类和小鼠细胞或组织： Qiagen® AllPrep DNA/RNA 试剂盒。这些试剂盒有 Mini（产品目录号 #80204）、Micro（产品目录号 #80284）和 FFPE 试剂盒（产品目录号 #80234）。

对于细胞，用于提交或随后 RNA 分离的样本应在 Qiagen® RNAprotect 细胞试剂（www.qiagen.com 目录号 #76526）中重新悬浮。样本可在 2-8°C 下保存长达 1 周，或在 -20°C 下无限期保存。对于冷冻保存，我们首选的介质是 CryoStor CS10，但我们也收到了使用自制冷冻保存介质保存的完好活细胞样本。

对于血液，请参阅我们关于血液采集和样本注意事项的详细文章。

一般提示

核酸应在冰上解冻，并在完全无菌且无核酸酶的环境和试剂中处理。在提取之前，可以使用 RNase Away 或类似的清洁试剂清洁样品周围的环境（包括移液器）。使用的所有试管和材料都应经过认证，不含 RNase/DNase。

RNA 对降解极为敏感。确保在使用前将 RNA 储存在 -80˚C 下，并在模板添加步骤中保持在 4˚C 下。解冻后轻轻摇晃 RNA 样本以混合，不要涡旋，并快速操作。纯化的 RNA 可以在 -20°C 下储存在无 RNase 的水中一个月，或在 -80°C 下储存长达一年。在这些条件下，应该检测不到 RNA 的降解。为避免多次冻融 RNA，我们建议在冷冻前将其分成较小的批次。每次冻融都会损坏 RNA，每次解冻可使克隆型发现减少多达 20%。  

此外，以较高浓度储存核酸可以对核酸产生保护作用。为了避免模板太稀，我们通常建议使用市售的 RNA 提取柱，其洗脱体积低于推荐体积。例如，如果方案建议以 50 µL 洗脱，则以 30-37 µL 洗脱。如果已经提取了 RNA 样本，iRepertoire 可以利用我们的内部浓缩方案，使用基于珠子的方法浓缩 RNA。但是，建议减少 RNA 提取后的样品处理步骤。

我们不建议固定样本。根据我们的单细胞经验，我们处理过用 1% PFA 固定的细胞，并且有数据表明固定确实会影响下游结果。与正常情况相比，成功的单细胞扩增减少了 60-70%。在大量细胞中，我们预计会出现类似的效果。尽管如果提交了足够的细胞，我们仍然能够获得一个文库，但我们从单细胞实验中知道 RNA 的交联会影响结果。

常见问题

建议的最低 RNA 完整性值 (RIN) 是多少？

一般情况下，建议 RIN 值 >7。但我们发现，我们的短读引物通常扩增 RIN >3 的样本，而我们的长读引物则扩增 RIN >5 的样本。

从 FFPE 中提取的 RNA 可以使用吗？

是的，可以使用来自 FFPE 的 RNA。如果 RNA 降解程度稍有不同（RIN 值介于 3 和 5 之间），我们建议使用短读引物​​。如果 RIN >5，长读引物应该可以扩增样本。如果 RIN 值小于 3，样本可能降解过度而无法扩增。

您有推荐的用于悬浮细胞的 RNA 提取试剂盒吗？

是的，我们建议细胞数超过 5*10 5（每列不超过 1*10 7）时使用 Qiagen RNeasy Mini 试剂盒（货号 74104），细胞数少于 5*10 5时使用 Qiagen RNeasy Micro 试剂盒（货号 74004） 。对于仅包含几百个细胞的样本，我们要求研究人员参考我们的 iPair 服务，因为它可能是研究中的一个很好的选择，并且可以完全跳过提取过程。

你们有推荐的 FFPE 提取试剂盒吗？

我们首选的试剂盒是 Qiagen 的 FFPE All-Prep（gDNA 和 RNA 试剂盒）（货号 80234）。在公司内部，我们还在淋巴结切片上测试了 Stratagene 的 Absolutely RNA FFPE 试剂盒（货号 400809），并取得了良好的效果。我们还看到其他研究 FFPE 肾活检样本的研究人员使用 Stratagene 试剂盒取得了良好的效果。一般来说，商业试剂盒提供最佳结果，我们直接遵循其协议。我们确实建议对 FFPE 样本使用 FFPE 专用试剂盒，因为这些样本可能具有挑战性。

您有推荐的组织 RNA 提取试剂盒吗？

我们推荐使用 Norgen 动物组织 RNA 纯化试剂盒（货号 25700）。通常，任何商用组织 RNA 提取试剂盒都能产生良好的效果。

我的细胞数量真的很低，在提取 RNA 时我应该使用载体 RNA 吗？

当您提取 500 个或更少的细胞时，通常建议使用载体 RNA。为防止提取过程中 RNA 的损失，应在 RNA 提取过程之前将载体 RNA 添加到样本中。如果使用载体 RNA，则难以评估原始样本的准确 RNA 浓度。因此，对于细胞计数较低的样本，我们建议您以较小的体积洗脱 RNA 以增加洗脱的 RNA 浓度。对于细胞计数极低的样本，我们要求研究人员参考我们的iPair 服务。我们通常会建议修改这种方法，以最大限度地增加获得的数据，同时避免提取 RNA。

相关文章