起始模板的选择：RNA、gDNA 和 cDNA

迄今为止发表的免疫组库测序论文中，大约一半使用基因组 DNA 样本，而另一半使用 RNA。虽然我们有适用于这两种样本类型的引物，但我们首选的原始模板是 RNA，我们用它来创建免疫特异性 cDNA 模板。

使用 RNA 进行免疫测序的好处有三点：

首先，使用 RNA 模板可以最大限度地增加 PCR 扩增所需的模板量。其次，RNA 比 gDNA 更敏感，因为每个细胞有多个副本。

使用基因组 DNA 的主要问题是包容性。每个人类细胞可能具有约 6.6 pg 的总基因组 DNA，其中重排的 V(D)J 只占很小的一部分。因此，如果在扩增中使用 100 ng 基因组 DNA，则仅代表约 16,000 个细胞，这导致对库的观察受到高度限制。尽管可以在反应中使用更多的基因组 DNA，特别是如果浓度很高，但可以添加到 PCR 化学中的 DNA 的物理体积仍然有限。相比之下，从 iRepertoire 的 RNA 试剂系统创建的 cDNA 模板将具有免疫特异性，从而最大限度地增加反应中包含的所需模板量。

最后，RNA 过滤掉重组中未使用的 V 基因片段和 J 基因片段，因为只存在表达的 V(D)J 片段。

背景噪音是使用 gDNA 作为模板生成测序文库的另一个问题。在 V(D)J 重排后，未参与重组的 V 和 J 片段仍将存在于基因组中，并可作为引物的完美结合位点。这些位点的结合将产生背景扩增、耗尽引物并引入偏差。

尽管存在上述缺点，那些更喜欢使用 gDNA 作为起始模板的人也有各种正当理由。样本更容易获得，甚至可以使用来自组织或载玻片的活检样本。此外，由于每个细胞可能只有一个成功重排的 V(D)J 拷贝，因此它可能更好地反映库的数量。换句话说，成功重排的 VDJ 的识别不会因表达水平而产生偏差，因为关系应该是每个细胞对应一个 V(D)J 重排。然而，人们也可以争辩说，T 细胞和 B 细胞受体的 RNA 表达水平可能更好地反映功能状态。

逆转录对免疫组库测序的重要性

客户还可以选择发送由寡核苷酸 dT 或随机六聚体引物创建的 cDNA，以供 iRepertoire 进行下游 V(D)J 分析。如果为多种不同类型的分析创建了单个 cDNA 源，或者您没有资源运送 RNA 或其他易碎材料，或者您没有剩余的 RNA，但为感兴趣的项目存储了 cDNA 模板，那么这可能很有用。

虽然我们确实接受 cDNA 样本，但出于多种原因，我们建议使用我们的免疫特异性引物来创建 cDNA。通过使用 iRepertoire 的 RT 试剂系统，与使用万能引物生成的文库相比，cDNA 文库的免疫特异性 cDNA 浓度将更高。非特异性 cDNA 文库包括来自细胞中任何表达蛋白质的 cDNA 序列，这减少了可用于扩增的免疫特异性 cDNA 模板的数量。此外，使用非特异性引物创建强大的 cDNA 文库需要大量的 RNA 输入。

iRepertoire 的扩增系统可以将输入 RNA 的量减少到建议的 100 ng（而且我们甚至用更少的量就成功实现了扩增），因为产生的 cDNA 文库具有免疫特异性。

那么，RNA、gDNA 还是 cDNA？答案实际上取决于您的研究目标和资源。如果您要寻找的库变化将由显性克隆代表，那么 gDNA 或 RNA 都可以。但是，如果您需要看到更广泛的多样性或真正的功能多样性，RNA 是更好的选择。如果您需要多种类型的测序分析，从一个 cDNA 池中提取可能是最简单且最具成本效益的。无论您的需求是什么，iRepertoire 都有产品和服务来帮助您实现目标。