细胞分选指南
单细胞免疫测序简介
与批量库分析不同，单细胞测序保持了单个免疫细胞中受体链之间的同源配对。据我们所知，我们的单细胞库测序服务iPair 是第一个面向消费者的捕获配对 TCR alpha-beta 或 BCR IgH-KL 链的服务。在扩增和测序的准备过程中，需要识别目标细胞，可能通过磁珠分离或染色进行分类，然后进行单细胞接种。这些步骤中的每一个都可以由您的实验室内部执行，也可以作为我们的服务在我们的服务中执行。
为了澄清起见，我们使用术语“分选”来指从大量细胞（如 PBMC）中分离出特定细胞（如 CD4+）的子集。术语“板”用于指将单个细胞物理沉积到 96 孔板的单个孔中。所有细胞都需要进行板化才能使用 iPair 服务，但并非所有细胞样本都需要进行细胞分选；这取决于您的个人研究目标。
启动 iPair 项目的方法有多种，概述如下。
在您的场所进行细胞分选和接种
如果您可以使用具有单细胞功能的 FACS，则可以使用iPair 接种试剂盒在您的站点进行单细胞分类和/或接种，然后将接种板发送给我们进行服务。强烈建议您在第一次提交真实样本之前进行分类验证。我们将通过扩增接种板的一部分来检查您的分类器和方法与我们的过程的兼容性；除非特别要求，否则不进行测序。此步骤可确保分类人员和分类器都经过验证，以便将来提交。任何偏差都必须重新验证。
仅在您的站点进行细胞分选
或者，您可以磁性分选或使用 FACS 在一个 Eppendorf 管中批量分选多个细胞，将细胞存储在 Qiagen 的 RNAprotect 细胞试剂（货号 76526）中，并在 4°C 下运送给我们。执行此操作时，请像往常一样批量分选，将细胞离心，去除所有上清液，并在 300-500 uL RNAprotect 细胞试剂中完全重新悬浮。收到细胞后，iRepertoire 的服务实验室将对其进行单细胞接种。
在我们的站点进行细胞分选和接种
如果您缺乏分选能力或希望 iRepertoire 处理这些步骤，则需要进行项目咨询。我们可以为您处理冷冻保存的大量细胞，并对感兴趣的细胞进行单细胞分选。费用因项目细节和样品处理要求而异。
欲了解更多信息，请访问我们的 iPair 页面。
细胞处理建议
以下是我们发现的可在 FACS 分选和/或接种过程中提高细胞活力（从而提高下游成功率）的细胞处理建议。
- 强烈建议使用活死染色来提高单细胞分析的成功率。
- 建议使用 100 或 130 微米的喷嘴或芯片尺寸，因为它有助于减轻细胞的压力。
- 降低样品压力也可以减轻细胞压力。如果仪器支持降低样品压力，请这样做。对于 Sony SH800 操作，内部样品室压力设置为 4（任意 10 级）。
- 对于 iPair 验证板，我们建议使用 Jurkat 细胞系（Sigma Aldrich 细胞系 88042803）
- 如果在您的现场进行接种，请在开始实验之前进行平板对齐。
- 无细胞内染色。我们发现，进行过细胞内染色的细胞的 iPair 扩增成功率极低。
