NGS 概述:从样本到测序再到结果
新一代测序 (NGS) 已成为识别与疾病状态相关的遗传变异和可变基因表达模式并提供临床相关机制见解的强大工具。整个 NGS 工作流程可分为四个步骤:样本提取、文库制备、测序和分析
步骤 1:样本提取
NGS 可以用于任何产生 DNA 或 RNA 的样本(例如细胞培养物、新鲜冷冻组织、福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组织、血液、唾液和骨髓)。有各种基于起始材料的提取方案可供选择,并且通常每种提取方法都经过优化,可以从相应的样本类型中获得最高质量和最大数量的核酸。提取后,应确定 DNA 或 RNA 的数量和质量,因为高质量的起始材料对于成功测序至关重要。核酸样本的纯度通常以 A260/280 值表示,可以使用分光光度计(例如 Thermo Scientific 的 Nanodrop(货号 ND-8000-GL))来确定。“纯”DNA 通常报告的 A260/280 读数为 1.8,而 RNA 更接近 2.0
要了解有关免疫组库测序样本提取的更多信息,请参阅我们的样本制备指南
第 2 步:文库制备
从 RNA 或 DNA 样本制备测序文库涉及两个基本步骤:1) 扩增以产生适当大小的目标序列池,2) 添加稍后将与 NGS 平台交互的测序接头。如果 RNA 是起始模板,则需要额外的步骤,其中首先通过逆转录将 RNA 转化为 cDNA。
PCR 扩增会产生一组特定大小的 DNA 片段(称为文库),这些片段与要使用的测序系统兼容。文库制备中使用的引物是根据目标序列设计的,这些序列范围从整个基因组到特定的 RNA 转录本。
接头连接步骤本质上是将扩增的 DNA 或 cDNA 片段(称为扩增子)与将与测序流动槽表面相互作用的特定寡核苷酸序列连接在一起。如果要在一次测序运行中对多个样本进行测序,则需要将唯一标识符或条形码连接到扩增子上。可以将最终完成的文库合并到一次测序运行中,然后在数据分析过程中进行“解复用”。
有关如何为免疫组库准备测序文库的具体信息,请参阅我们的免疫组库测序页面。
步骤3:DNA测序
并行测序使用 NGS 平台进行。将文库加载到测序仪上,然后测序仪逐个“读取”核苷酸。产生的读取数量将根据所用的测序平台和试剂盒而有所不同。已经开发了几种 NGS 方法,包括焦磷酸测序、连接测序 (SOLiD)、合成测序 (SBS – Illumina) 和 Ion Torrent 测序。Illumina 测序是迄今为止最受欢迎的,产生了全球 90% 的测序数据(数据来自 Illumina 网站)。
Illumina 平台
虽然所有 NGS 平台都可对数百万个 DNA 或 cDNA 小片段进行测序,但存在多种不同的测序技术。有些平台可以产生比其他平台更多的读取或不同的读取长度。最流行和最成功的测序技术是由 Illumina 开创的。Illumina 的仪器产品组合包括台式(iSeq、MiniSeq、MiSeq、NextSeq)和生产规模(NextSeq、HiSeq 和 NovaSeq)测序平台。
Illumina 测序仪使用玻璃流动池,该流动池上涂有数百万个与测序接头互补的寡核苷酸。
每个文库片段与引物杂交,并进一步扩增,产生数百万至数十亿个克隆簇。然后,使用荧光标记的核苷酸合成每个片段的互补链。添加每个标记核苷酸后,对流动池进行成像,并记录每个簇的发射。荧光发射波长和强度用于识别模板的序列。
步骤 4. 对齐和数据分析
测序完成后,使用专门的软件来理解产生的大量数据。首先,必须对读取进行质量、扩增子大小和配对末端之间的一致性过滤(有关读取长度和配对末端读取的更多信息,请继续关注我们即将发布的 NGS 注意事项页面)。然后将读取组装并与参考基因组比对。最后,可以将读取(组装或原始)与参考序列或来自另一个样本的读取进行比较,以根据疾病状态等识别变异。如果读取与参考基因组比对,则可以使用变异注释将变异与已知基因或调控序列相关联。有关与免疫组库特别相关的生物信息学分析的信息,请参阅学习中心文章,其中描述了iRepertoire 的数据分析平台/服务。
诊断/临床应用中的测序
随着测序成本的下降,测序在诊断和临床中的应用变得越来越普遍。NGS 生成的数据可用于阐明疾病的致病机制、临床诊断、治疗选择和预后。与其他分析方法(如基于蛋白质染色的方法)相比,测序更具信息量,因为它可以生成有关基因组的一系列详细信息。
NGS 的一个主要关注领域是癌症治疗,因为特定肿瘤的基因组成可以帮助肿瘤学家预测哪些治疗方法可能有效。NGS 可用于识别肿瘤特异性变异,例如拷贝数变异、突变和基因表达变异。测序面板包括直接针对特定转录本或感兴趣的基因组区域的引物,通常用于肿瘤学应用,以降低成本并更有效地启动基因型定向靶向疗法。根据测序结果,患者可以接受靶向治疗或免疫治疗。
随着我们不断认识到免疫系统在癌症反应和癌症微环境中所起的作用,免疫组库测序对癌症研究越来越重要。要了解有关免疫组库测序的更多信息,请访问我们专门针对该主题的页面。
随着新技术的开发,使文库制备和数据分析等劳动密集型过程实现自动化,测序无疑将变得更加普及。