如何进行免疫组库测序

通过测序捕获 免疫组库的完整克隆多样性 可以揭示有关疾病病理和预后的重要信息。不同疾病患者的免疫组库测序可能在组库组成和多样性方面显示出与健康对照者的数量或质量差异。 

质变可能表现为 T 细胞或 B 细胞中疾病特异性 CDR3 的共享增加。量变可能表现为库多样性的增加和减少。捕捉质变和量变需要一种  既敏感（以包括所有 CDR3）又无偏（以允许对所有 CDR3 进行相对定量） 的免疫库测序方法。

iRepertoire 的免疫组库测序方法是：

  • 对包容性分析高度敏感 
  • 无偏见，可量化  
  • 能够覆盖关键抗原识别区域  
  • 独特定制，提供具体信息

有关免疫组库测序如何应用于健康的示例，请参阅学习中心文章 “为什么要对免疫组库进行测序？” 

定量和包容性免疫组库分析

虽然一个人的免疫系统中有数十万种不同的克隆型，但只有少数克隆型构成了免疫库的大部分。因此，对一个人的 CDR3 克隆型进行采样会产生如下图所示的分布。 

一个人的克隆型分布。我们所有的 PCR 方法都增加了稀有克隆型的发现，以减少包容性免疫测序的偏差。

这种长尾分布导致信噪比较低，因为频率较高的 CDR3 在免疫测序库中会过度表达。因此，为了有效地捕获免疫库的全部广度和深度，测序方法必须具有包容性和定量性。 

由于需要进行扩增才能制备测序文库，因此很难获得特定克隆型的绝对数量信息。扩增过程偏向于大量且较小的扩增子，这可能导致频率较低的稀有扩增子在最终文库中代表性不足。iRepertoire 开发了两种不同的多重 PCR 方法，以增加稀有克隆型的发现并减少其免疫组库测序技术中的这些偏差。 

这些技术在我们的扩增技术文章中有深入的描述。

决定按什么顺序

希望对免疫组库进行测序的实验者将需要确定要针对的 T 细胞和/或 B 细胞受体 (TCR 和 BCR) 基因区域、是否使用 DNA 或 RNA 作为起始材料、以及是否对大块组织或 单个细胞进行测序，所有这些都取决于研究的目标。 

选择要测序的区域： 

TCR 和 BCR 在抗原识别中发挥最重要作用的区域也是最易变的区域。这些可变区域由基因片段的随机改组构成，对于 BCR 来说，则由体细胞突变构成。 可变区域中最 易变的部分是 CDR3 区域。因此，在进行免疫组测序时，以 CDR3 区域为目标至关重要。iRepertoire 的所有引物系统都 涵盖了高度可变的 CDR3 区域。 

对整个可变区进行测序可以提供更多信息，但这些额外的信息是以增加测序读取或降低测序覆盖率为代价的。有关测序覆盖率的更多信息，请参阅我们关于 选择读取深度的帖子。 

选择起始材料： 

虽然 RNA 和 DNA 测序都可以提供免疫组库的图像，但只有 RNA 测序才能反映实际表达的 TCR 和 BCR 序列库（有关更多信息，请参阅我们关于 模板选择的帖子）。 

选择批量组织或单细胞测序： 

最后，需要进行批量测序来分析免疫组库多样性，但批量测序会丢失给定 B 细胞或 T 细胞内 BCR/TCR 链的同源配对信息。希望研究配对链之间关系（特别是克隆型）的研究人员应进行单细胞测序。有关如何对单细胞进行测序的更多信息，请参阅我们关于 细胞分选的帖子。

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