iPair：iRepertoire 的单细胞免疫测序服务
为什么是单细胞？
一旦对大量细胞样本进行 RNA 提取，与 TCR-alpha 和 -beta 链或 Ig-重链和 -轻链的物理同源配对相关的信息就会丢失。我们开发了单细胞免疫测序服务iPair ，以便可以通过捕获链配对来分析单个细胞的全部内容，而无需培养细胞。
iPair 于 2016 年 11 月上市。据我们所知，iPair 是首个专门设计用于从人类 T 细胞和 B 细胞中捕获物理配对的 TCR alpha/beta 或 BCR IgH/KL 可变区的消费者服务。从那时起，我们的服务已扩展到涵盖小鼠样本，以及 TCR gamma/delta 配对的开发。
工作原理
iPair 依赖于我们的arm-PCR 技术。借助 iPair，我们使用基于 FACS 的方法将单个细胞放入 96 孔 iCapture 板中。我们开发了多重引物混合物，以在低反应量下同时平衡同一 PCR 孔中两个基因座的扩增。然后，我们使用带有 500+ 循环测序试剂盒的 Illumina MiSeq 平台对结果进行测序，以便可以调用可变区序列。
iPair 通常可实现>90% 的扩增成功率，而使用我们的一体化靶向测序混合物，配对成功率可超过 80%。
iPair 引物
iPair 引物是使用我们的长读引物系统设计的，该系统涵盖了人类样本从 FR1 内到 C 基因的开头（小鼠长读引物从 FR2 内开始）。由于我们只缺少 V 基因的前约 30-50 个核苷酸，因此可以很容易地从国际 ImMunoGeneTics 信息系统 (IMGT) 上的参考序列推断出这些序列。引物的放置产生了适合 Illumina 平台上 500 个循环试剂盒（250 个双端读取）大小的库。我们有许多客户使用推断的序列从数据中重建功能性 TCR，没有任何问题，因为大多数 TCR 都存在于数据中，包括 CDR1、CDR2 和 CDR3。
要了解有关 iRepertoire 引物系统的更多信息，请参阅我们的学习中心有关iRepertoire 引物系统的文章。
使用 iPair+ 进行单细胞表型分析
我们的单细胞表型分析服务iPair+ 提供了使用专门引物分析的细胞的额外功能信息。iPair+ 有两种不同的可定制选项，哪种最适合您的项目在很大程度上取决于您想要调用哪些表型目标、您有多少个目标以及您的预算。
基因特异性引物法涉及在同一孔中同时扩增表型靶标和 VDJ 受体引物。有 30 种基因特异性引物可用于人类样本；小鼠样本必须使用寡聚脱氧胸腺肽 (oligo-dT) 方法处理。
使用基因特异性引物的主要优势是价格实惠。因为所有操作都在一个板上进行，所以无需支付额外的处理费用。但是，高表达的表型靶标可能会在测序过程中占用大量读取，这可能会导致 VDJ 丢失。如果只使用少量（约 10-15 个）表型标记，我们建议使用基因特异性方法。
我们的第二种方法是基于寡核苷酸脱氧胸苷酸（oligo-dT）的方法。寡核苷酸脱氧胸苷酸（oligo-dT）面板包括 100 多个针对人类或小鼠样本的基因靶标。在此过程中，细胞被裂解，并使用寡核苷酸脱氧胸苷酸（oligo-dT）引物混合物进行逆转录。然后，将该 cDNA 分成两块板：一块用于 VDJ 扩增，另一块用于表型分析。由于每个孔中的细胞都单独带有条形码，因此在下游数据分析期间，表型数据可以与 VDJ 信息叠加。虽然这确实会增加处理成本，但它允许用户更好地控制表型靶标的测序深度。
请联系我们来查看基因特定或寡聚dT面板列表。
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应用
免疫疗法的新应用以及对肿瘤微环境重要性的日益认识导致了对单细胞水平免疫分析的需求日益增长。iPair 可用于 CAR-T 开发、计算细胞亚群中的克隆频率或追踪治疗后的特定淋巴细胞。
