iRepertoire 的放大技术

免疫组库测序的挑战

免疫组库测序的独特挑战使得开发针对组库的文库制备技术成为必要。为了充分捕捉免疫组库的多样性，必须使用扩增技术，以考虑对小扩增子的偏向性，并扩增自然丰度高的模板以外的稀有克隆型。考虑到给定组中每个克隆型有多种链类型，并且组库的多样性必须考虑基因重组、表达和超突变，这绝非易事。

iRepertoire 的多重 PCR 扩增技术专门用于扩增免疫系统的 B 细胞受体 (BCR) 和 T 细胞受体 (TCR) 链，同时考虑了包容性和定量性。

iRepertoire 的多路复用解决方案

iRepertoire 提供两种不同的多重 PCR 方法，这两种方法都可以扩增样本中的所有 V(D)J，包括高度可变的 CDR3 区域。使用 arm-PCR（扩增子拯救多重 PCR，专利 7,999,092），您可以以极高的灵敏度从人类或小鼠样本中扩增您选择的链，从而包括样本中存在的所有多样性，即使是极其罕见的克隆型。使用 dam-PCR（二聚体避免多重 PCR，正在申请专利），您可以以比竞争方法更定量的方式扩增任何或所有 BCR 和 TCR 链。

扩增子拯救多重 PCR (arm-PCR)

Arm-PCR 在初始组合逆转录 (RT) 加 PCR 第一轮中使用了数百个嵌套的内外基因特异性引物。反向的内外引物均可在 RT 期间参与第一链的合成，如果存在任何二级 RNA 结构导致内部引物结合位点在 RT 期间无法进入，这一点就尤为重要。

外部引物有助于提高反应的灵敏度，因为它增加了内部引物结合的目标模板丰度。由于嵌套引物混合物经过多次结合和延伸循环，因此arm-PCR 是发现稀有克隆型的绝佳技术解决方案。RT-PCR1 完成后，目标扩增子被拯救，并使用新鲜酶进行第二轮 PCR。对于 PCR2，使用识别第一轮扩增期间引入的共享标签序列的公共引物进行进一步扩增。

在第一轮 arm-PCR 中，内外 TCR/BCR 特异性引物扩增目标靶标，提高灵敏度并添加公共引物结合位点

了解有关 arm-PCR 的更多信息

避免二聚体的多重 PCR (dam-PCR)

iRepertoire 的 dam-PCR 技术可让您选择任意组合的 TCR 和 BCR 链，在一次反应中同时进行扩增。这是通过独特的单循环结合和延伸步骤以及中间严格的清理步骤实现的，这些步骤可避免有害的二聚体的形成。首先，仅添加 3′ 引物并执行一个结合和延伸步骤。未结合的 3′ 引物被洗掉，然后添加 5′ 引物。在另一个单循环结合和延伸方案之后，5′ 引物被洗掉。添加与前两个步骤中引入的公共引物位点结合的引物，以进行多循环、指数扩增。

Dam-PCR 还允许包含唯一分子指数 (UMI)，这样就可以标记每条 RNA 链以进行直接定量，并消除 PCR 和/或测序错误。这增加了对测序目标的信心，并且量化允许调查免疫适应组中的链间比率。因此，虽然 arm-PCR 提供了有关特定链的免疫库的全面、半定量概述，但 dam-PCR 提供了对任何或所有 BCR 和 TCR 链的特定克隆型频率的更定量的观察。