超越模板切换
研究免疫组库的完整克隆多样性需要独特的定制测序方法。市场上的大多数免疫测序化学方法都依赖于一种称为模板切换的技术的某种变体，该技术从对给定样本中的所有 RNA 进行非靶向扩增开始。iRepertoire的专有多重 PCR 技术使用专门为免疫测序设计的引物，可实现更灵敏和定量的扩增。
什么是模板切换？
模板切换的好处（理论上）是它能够以相对灵敏的方式捕获完整的 cDNA 序列（5′ 端未知）。因此，模板切换的变体通常用于整个转录组的散弹枪测序。
第一步是通过使用 3′ oligo-dT 引物进行逆转录，捕获样本中几乎任何带有 poly A 尾巴的 mRNA。模板切换与其他随机 poly-A 尾巴扩增的区别在于逆转录酶的次要功能，即在特定条件下将一串非模板碱基对整合到 cDNA 的 5′ 端。
然后用专门设计的 5′ 寡核苷酸靶向非模板碱基。添加的碱基成为模板（因此得名模板开关）。在此第二个扩增步骤中，可以使用针对目标的 3′ 寡核苷酸提取特定的 RNA 群体；在免疫测序的情况下，是 B 细胞或 T 细胞受体基因。
iRepertoire 的技术有何不同？
iRepertoire 的多重 PCR 技术从一开始就以 V(D)J RNA 为目标，提供更灵敏、更强大的免疫测序靶标扩增。任何给定样本的免疫组库都将由一些极其稀有的克隆型和一些极其丰富的克隆型组成。虽然模板切换可用于特异性扩增 BCR 和/或 TCR 基因，但在模板切换的第一步中，mRNA 会被无差别地转换为 cDNA。这反映在最终测序结果中：许多非 VDJ RNA 将被纳入，从而降低所需信号。此外，非模板碱基对掺入步骤偏向于带帽 RNA 结构，因此样本的质量至关重要。
iRepertoire 技术相对于传统模板切换的优势：
- 可以检测极其罕见的克隆型
- 对 RNA 降解具有很强的抵抗力，可以实现困难的样本扩增
- 选择性化学选项以满足特定项目目标
- 无与伦比的灵敏度和减少偏差
iRepertoire 的多重 PCR 技术从第一步开始就专门逆转录和扩增 BCR 和 TCR 转录本，从而能够检测极其罕见的克隆型并保持不同克隆型的相对丰度。由于可以靶向部分受体，iRepertoire 的技术对 RNA 降解也更具抵抗力，能够扩增诸如 FFPE RNA 等困难样本。根据项目目标，您可以从两种专门为免疫组测序开发的不同化学方法中进行选择。
| 模板切换 | iRepertoire 的技术 |
|---|---|
| cDNA 合成 需要Poly-A 尾 | cDNA 合成不需要Poly-A 尾巴 |
| 模板转换寡核苷酸的添加部分依赖于 5’cap | V(D)J 特异性引物独立于 5′ 帽 进行扩增 |
| 文库仅包含完整的V(D)J 转录本和脱靶表达产物 | 文库包含完整和 FFPE 损坏的V(D)J 转录本 |
臂PCR
Arm-PCR是 iRepertoire 的旗舰技术，专门用于稀有克隆型发现，可对相对克隆型频率进行半定量比较。arm-PCR 的极高灵敏度是通过使用一系列嵌套的内部和外部引物来实现的，这些引物可识别 B 细胞和 T 细胞受体转录本的 V 区和 C 区。外部引物会增加靶标池，而内部引物会附加公用接头。在第二系列扩增步骤中，使用针对公用接头的引物来增加信号，确保只有全长、剪接的 VDJC 才能进行测序。
聚合酶链反应
Dam-PCR具有极高的定量性，并针对减少错误和偏差进行了优化。Dam-PCR 首先使用模板特异性引物进行单循环结合和延伸步骤。接下来进行清理步骤以消除未使用的引物。此步骤以及唯一分子标识符 (UMI) 的添加使 dam-PCR 成为市场上最定量的免疫测序技术。UMI 的存在还有助于在生物信息学分析过程中识别 PCR 和/或测序错误。准确识别 PCR 和/或测序错误的能力对于体细胞突变丰富的 BCR 库分析尤其有益。
对于iRepertoire 的两种专有多重 PCR 解决方案——arm -PCR和dam-PCR——分离目标 RNA 的步骤和指数扩增这些序列的步骤在物理和时间上是分开的，从而实现了无与伦比的灵敏度和偏差减少。
